RNA-Seq-Pipelines bestehen aus mehreren Schritten, in denen sich Unsicherheiten fortpflanzen. Diese Fallstudie isoliert gezielt kleine, zufällige Sequenzierfehler und misst, wie stark sie sich bis zu DE- und GSEA-Ergebnissen durchschlagen. Methodisch unterscheiden wir drei Grundfälle der Fehler- fortpflanzung: (i) Fortpflanzung durch Funktionen via Linearisierung (Delta-Methode), (ii) quadratische Kombination unabhängiger Beiträge (absolute bzw. relative Unsicherheiten) und (iii) Kombination abhängiger Beiträge über Kovarianzen [4]. Für stark nichtlineare oder implizite Modelle empfiehlt sich eine Monte-Carlo-Propagation, eine simulationsbasierte, stochastische Methode, bei der man zufällige Stichproben aus den Unsicherheitsverteilungen der Eingangsgrößen zieht, die vollständige Analyse für jede Stichprobe ausführt und so die empirische Verteilung der Ausgabegrößen erhält [4]. Auf Basis von GSE52778 (4 Spender, 4 Bedingungen) lief ein automatisierter Workflow (Trim Galo- re!, STAR, featureCounts, DESeq2 mit dem Modell ~ donor + condition). In die FASTQ-Dateien wurden ausschließlich Basensubstitutionen mit per-Base-Raten von 0.01 %, 0.05 %, 0.10 % injiziert (jeweils N = 1000), die fehlerfreie Analyse dient als Referenz. Global bleiben PCA-Struktur und LFCs sehr stabil (Pearson/Spearman ≥ 0.95) ohne systematischen Bias (Bland-Altman). Lokal zeigt sich eine ausgeprägte Schwellenfragilität, dass die Anzahl der p-Wert mit der Fehlerrate steigt und dass der Jaccard-Index zwischen DEG-Listen dosisabhängig abnimmt. Diese Schwellenfragilität wirkt sich bis auf die funktionelle Ebene aus. Während übergeordnete GSEA-Themen stabil bleiben, verschieben sich einzelne GO-Terme in ihrer Rangfolge. Die Ergebnisse unterstreichen daher die Notwendigkeit, DEG-Listen durch Stabilitätsmaße wie den Jaccard-Index oder Bland-Altman-Analysen zu kontextualisieren. Für künftige Simulationen empfiehlt es sich, das Modell um weitere Faktoren wie Quantifizierungsunschärfen und Sequenzabdeckung zu erweitern.

@mastersthesis{FIRAC25,
	author	 = {Marcos Ivan Chow Castro},
	title	 = {{Fehlerfortpflanzung in RNA-seq Analyse}},
	advisors	 = {Andrew Torda},
	year	 = {2025},
	month	 = {10},
	school	 = {Universität Hamburg},
	howpublished	 = {{Online \url{https://wr.informatik.uni-hamburg.de/_media/research:theses:marcos_ivan_chow_castro_fehlerfortpflanzung_in_rna_seq_analyse.pdf}}},
	type	 = {Master's Thesis},
	abstract	 = {RNA-Seq-Pipelines bestehen aus mehreren Schritten, in denen sich Unsicherheiten
			fortpflanzen. Diese Fallstudie isoliert gezielt kleine, zufällige Sequenzierfehler und misst,
			wie stark sie sich bis zu DE- und GSEA-Ergebnissen durchschlagen. Methodisch unterscheiden wir
			drei Grundfälle der Fehler- fortpflanzung: (i) Fortpflanzung durch Funktionen via
			Linearisierung (Delta-Methode), (ii) quadratische Kombination unabhängiger Beiträge (absolute
			bzw. relative Unsicherheiten) und (iii) Kombination abhängiger Beiträge über Kovarianzen [4].
			Für stark nichtlineare oder implizite Modelle empfiehlt sich eine Monte-Carlo-Propagation,
			eine simulationsbasierte, stochastische Methode, bei der man zufällige Stichproben aus den
			Unsicherheitsverteilungen der Eingangsgrößen zieht, die vollständige Analyse für jede
			Stichprobe ausführt und so die empirische Verteilung der Ausgabegrößen erhält [4]. Auf Basis
			von GSE52778 (4 Spender, 4 Bedingungen) lief ein automatisierter Workflow (Trim Galo- re!,
			STAR, featureCounts, DESeq2 mit dem Modell ~ donor + condition). In die FASTQ-Dateien wurden
			ausschließlich Basensubstitutionen mit per-Base-Raten von 0.01 \%, 0.05 \%, 0.10 \% injiziert
			(jeweils N = 1000), die fehlerfreie Analyse dient als Referenz. Global bleiben PCA-Struktur
			und LFCs sehr stabil (Pearson/Spearman ≥ 0.95) ohne systematischen Bias (Bland-Altman). Lokal
			zeigt sich eine ausgeprägte Schwellenfragilität, dass die Anzahl der p-Wert mit der Fehlerrate
			steigt und dass der Jaccard-Index zwischen DEG-Listen dosisabhängig abnimmt. Diese
			Schwellenfragilität wirkt sich bis auf die funktionelle Ebene aus. Während übergeordnete
			GSEA-Themen stabil bleiben, verschieben sich einzelne GO-Terme in ihrer Rangfolge. Die
			Ergebnisse unterstreichen daher die Notwendigkeit, DEG-Listen durch Stabilitätsmaße wie den
			Jaccard-Index oder Bland-Altman-Analysen zu kontextualisieren. Für künftige Simulationen
			empfiehlt es sich, das Modell um weitere Faktoren wie Quantifizierungsunschärfen und
			Sequenzabdeckung zu erweitern.},
}